Приспособления для ковки: Приспособления для ковки — купить оборудование по цене производителя с доставкой по России и СНГ

Краткое изложение протокола уточнения под управлением ПК, использованного в данном исследовании. Протокол уточнения включает этап крупнозернистого моделирования для определения механических деформаций, которые должны быть выполнены на этапе уточнения всех атомов, где молекула механически деформируется. Крупнозернистый AWSEM с эволюционными ограничениями из потенциала сверхглубокого обучения (AWSEMER-UD) (11) моделировался при постоянной температуре 300 K, исходя из исходной структуры модели, взятой из репозитория CASP12.Затем крупнозернистая траектория используется для нахождения основных компонентов движений позвоночника. Затем был выбран один главный компонент из числа тех, у которых были наибольшие собственные значения, в соответствии с влиянием его движения на изменение количества контактов (подробности см. В «Материалы и методы» ). Эти движения потребуют взлома. Вариации значения выбранного главного компонента во время траектории постоянной температуры показаны серым цветом. В пяти последующих моделированиях уточнения явного растворителя для всех атомов зонтичный потенциал применялся к образцу вдоль выбранного главного компонента.Контрольные точки потенциалов гармонического смещения были выбраны в диапазоне от -2 до 2 в единицах стандартного отклонения значений главных компонент, выбранных во время крупнозернистого моделирования AWSEMER-UD. Внизу показывает исходную и исходную структуры с соответствующими значениями главных компонентов.

Сводка результатов уточнения. ( A ) Среднеквадратичные значения исходных структур (черные), уточненных структур с наименьшим среднеквадратичным значением из группы «Seok» («Seok Best», зеленый) (29) и структур с наименьшим среднеквадратичным отклонением с использованием Протокол AWSEM-PCA («PCA Best», синий).Кроме того, наименьшее среднеквадратичное значение, полученное при моделировании трех целей (TR884, TR872 и TR948), где барьеры боковой цепи были уменьшены вдвое [PCA Best half-DIHE (двугранный)], отмечены красными треугольниками. ( B ) Разница в среднеквадратичных значениях (Δrmsd; обратите внимание, что это противоположно значениям −Δrmsd, показанным в таблице 1) между исходными структурами и структурами в Seok Best (зеленый), PCA Best (синий) и «Лучший полуфабрикат СПС ДИГЕ» (красный). Черная линия проводится при значении Δrmsd = 0 в качестве ориентира для глаза.( C ) Среднеквадратичные значения исходных структур (черный), слепо выбранных структур из группы Seok (зеленый), группы «Feig» (красный) (30), уточнение под управлением ПК («PCA Select (Top1 ), ”Синий) и структура с наименьшим среднеквадратичным отклонением из пяти верхних выборок (“ Выбор PCA (Top5) ”, голубой). ( D ) Разница в среднеквадратичных значениях между исходными структурами и структурами в группах Seok (зеленый), Feig (красный), PCA Select (Top1) (синий) и PCA Select (Top5) (голубой) . Черная линия показана при Δrmsd = 0 в качестве ориентира для глаза.

Сводка результатов уточнения

Уточнение под управлением ПК приводит структуру к исходному состоянию.

Наиболее поразительный результат наших тестов уточнения заключается в том, что механические деформации, доступные при уточнении под управлением ПК, вызывают значительные изменения структуры белка, которые обычно не происходят в протоколах уточнения чистой молекулярной динамики с ограничениями структуры при постоянной температуре. Практически для всех целей отбор проб под управлением ПК приводит некоторые траектории к структурам, которые ближе к исходному состоянию, чем исходные модели.Несколько особенно драматических структурных перестроек, которые улучшают структурную точность, проиллюстрированы на рис. 3. На рис. 3 показаны структуры до и после уточнения под управлением ПК. TR866 претерпел относительно большие изменения петлевых структур на двух сторонах своей структуры во время моделирования уточнения. В уточнении TR872 под руководством ПК вся короткая спираль на N-конце переворачивается в более нативную конформацию, чем была обнаружена в исходной структуре. При уточнении TR947 многоспиральный домен, который выступал в растворитель, вступает в контакт с остальной частью свернутого домена, как это видно на кристаллической структуре.Такие драматические структурные изменения в больших масштабах длины не происходят в столь же короткие сроки в обычных моделях уточнения на основе фиксированных ограничений.

Три примера конформационных изменений при уточнении, где уточнение под управлением ПК значительно улучшает структуру: TR866, TR872 и TR947. ( Top ) Во всех этих случаях исходные структуры (прозрачный красный) имеют по крайней мере один домен, который претерпевает значительный структурный переход (обозначен стрелками).Эти переходы поощряются управляющими потенциалами ПК. Полученные уточненные структуры показаны синим цветом. Соответствующие экспериментально определенные структуры показаны белым цветом. Структурные представления полного списка белков в этом исследовании показаны на рисунке S7. ( Нижний ) Переновзвешенные профили свободной энергии в зависимости от выбранной главной компоненты нанесены на график для каждого набора уточняющих имитаций. Вертикальные оранжевые, зеленые, голубые и синие полосы указывают значения главных компонентов исходной, выбранной верхней 1, самой низкой среднеквадратичной ошибки и экспериментально определенных структур, соответственно.Горизонтальная красная линия указывает относительный порог свободной энергии в 2kBT от наиболее вероятного значения главного компонента в соответствии с повторным взвешиванием имитаций уточнения. В схеме выбора структуры мы сначала применили «фильтр свободной энергии», который выбирает структуры со значениями PC в областях ниже этого порога 2kBT. Среднее значение статистического потенциала для всех атомов RWplus (31) нанесено на график как функция значения главного компонента ( Нижний ).

Сводка слепо выбранных моделей с использованием схемы машинного обучения со статистической энергией в качестве характеристик.

Схема структурного уточнения под управлением ПК проверяет структуры в широком диапазоне значений основных компонентов, некоторые из которых близки к значениям, подходящим для кристаллической структуры, но также и другие значения, которые находятся далеко и, следовательно, уводят структуры в сторону от кристаллических структур. . Поэтому, чтобы ограничить начальный пул структур, которые должны учитываться при слепом выборе, мы применили «фильтр свободной энергии».Поскольку в протоколе используется выборка по важности, можно найти профиль свободной энергии вдоль главного компонента в качестве приблизительной «координаты реакции». Затем фильтр свободной энергии выбирает те структуры в областях пространства главных компонентов, где относительная свободная энергия подансамбля, соответствующая этому значению главного компонента, менее чем на 2kBT выше, чем свободная энергия, соответствующая наиболее вероятному значению главного компонента в соответствии с повторное взвешивание уточняющих симуляций (рис.3).

После применения фильтра свободной энергии протокол выбора продолжается с применением схемы логистической регрессии на основе машинного обучения, которая выбирает пять моделей из пула уточнения для каждой цели белка. Как показано на рис. 2 и в таблице 1, с точки зрения процента улучшаемых структур модель с наивысшей оценкой, полученная с помощью этой процедуры (первая позиция), конкурирует с двумя наиболее эффективными командами CASP12. Наша схема выбирает «1 верхних» выбранных структур, структурная точность которых улучшена по сравнению с исходными моделями для 9 из 20 целей, тогда как было обнаружено, что 10 из 20 целей были улучшены в лучших выбранных структурах, о которых сообщили Сек и Фейг.Лучшие структуры из топ-5 структур, выбранных из уточнения под управлением ПК, лучше, чем исходные структуры для 12 из 20 целей. Для тех целей, которые были успешно уточнены до более низкого среднеквадратичного значения, чем у исходной модели, величина улучшения среднеквадратичного значения, обнаруженная в исследованиях Сока и Фейга, обычно составляла ∼0,1 Å. Однако для протокола уточнения под управлением ПК улучшения имеют в среднем значительно большую величину, чем те, которые были обнаружены при использовании других методов, причем наиболее резкое улучшение по сравнению с уточнением под управлением ПК составляет ∼4 Å (рис.2 D ). Отобранные топ-5 структур были дополнительно протестированы на предмет их компетентности для решения проблемы фазирования с использованием молекулярного замещения (MR) на основе существующих данных дифракции рентгеновских лучей. Показатели функции трансляции Z (TFZ) были улучшены с помощью схемы уточнения структуры под управлением ПК для всех семи целей в нашем тесте ( SI, приложение , таблица S2). Это демонстрирует, что слепо выбранные модели из уточнения под управлением ПК могут помочь в решении нефазированных рентгеновских кристаллических структур.

Исследование поверхности свободной энергии по подобию кристаллической и исходной структур.

Вера в то, что выполнение полностью атомных симуляций при достаточном времени приведет к почти естественным структурам, неявно опирается на представление о том, что энергетические ландшафты, создаваемые текущими полностью атомными силовыми полями, на самом деле направляются к экспериментально определенным структурам для белковых последовательностей которые изучаются (32). Даже если нынешние атомистические ландшафты, на самом деле, в достаточной степени распределены по каналам, проблемы с отбором проб с полностью атомными моделями из-за медленных режимов перегруппировки усложняют определение истинного минимального бассейна свободной энергии для любой данной белковой последовательности.Чтобы увидеть, действительно ли полностью атомистический ландшафт надлежащим образом связан с рентгеновской структурой, мы попытались определить относительную свободную энергию ансамбля структур, близких к исходным модельным структурам, и ансамбля структур, близких к известным кристаллическим структурам, путем расчета относительные свободные энергии различных значений выбранного главного компонента, используемые в наших уточняющих моделированиях. В большинстве случаев подансамбль с главным компонентом, который соответствует кристаллической структуре, находился в пределах 2kBT от минимума профиля свободной энергии ( SI Приложение , рис.S1), поддерживая идею о том, что текущее атомистическое силовое поле направляется к нативным структурам. Тем не менее, для нескольких целей самые низкие среднеквадратичные значения, взятые во время моделирования уточнения, все еще были выше типичного кристаллографического разрешения ~ 2 Å; т.е. в непосредственной близости от экспериментально определенных структур выборка не проводилась. Чтобы отобрать образец ближе к экспериментально определенной структуре, может потребоваться отбор образцов по дополнительным основным компонентам, как обсуждается ниже.В качестве альтернативы, некоторые аспекты текущего силового поля, которые не соответствуют кристаллической структуре мономера, могут препятствовать отбору образцов таких почти естественных структур. Наконец, кристаллические контакты или наличие дополнительных партнеров взаимодействия в кристалле, которые не были включены в моделирование уточнения, могут привести к этому несоответствию.

Для дальнейшего изучения складчатого ландшафта вблизи экспериментально определенных структур, мы выполнили дополнительное моделирование зонтичной выборки для одной из целей уточнения, TR872.TR872 был выбран для дальнейшего анализа по нескольким причинам. Экспериментально определенная структура TR872 была решена как мономер, и поэтому мы не ожидаем осложнений, связанных с влиянием отсутствующего олигомерного интерфейса на моделирование уточнения с использованием только мономера. Хотя исходная модель TR872, которая была предоставлена ​​для доработки во время конкурса CASP12, имеет относительно высокое среднеквадратичное значение по сравнению с экспериментально определенной структурой (5,589 Å), уточнение под руководством ПК позволило существенно усовершенствовать эту исходную модель до такой структуры: в лучшем случае чуть выше кристаллографического разрешения (2.6 Å). Более того, эта мишень была тщательно изучена Хео и Фейгом (30) и была обнаружена ими как трудная для уточнения с помощью типичного основанного на ограничениях моделирования с полным атомным уточнением. Позже они также показали, что силовое поле действительно имело ансамбль структур с минимальной свободной энергией, который находится в пределах экспериментальной точности (2 Å) в соответствии с их обширным моделированием, в котором использовался тот же полностью атомный потенциал, который использовался в настоящем исследовании (27).

Моделирование, предназначенное для исследования ландшафта свободной энергии между моделью и экспериментально определенными структурами, было инициализировано, начиная как со структуры, имеющей наименьшее среднеквадратичное значение, до исходной, взятой во время моделирования уточнения («модельная» структура), так и с экспериментально определенная структура.Отбор проб проводился по Q _diff , параметру порядка, который интерполирует между двумя структурами (подробности см. В «Материалы и методы »). Полученные профили свободной энергии после повторного взвешивания предполагают, что существует небольшой барьер, разделяющий структурные ансамбли модели и экспериментально определенную структуру (Рис. 4 A и B , Top ). Структуры в бассейне свободной энергии, расположенном рядом с модельной структурой (бассейн B), как правило, более неоднородны, чем структуры в бассейне, ближайшем к рентгеновской структуре (бассейн A), что можно увидеть по большей дисперсии в конструкции (рис.4 A и B , Top ) и параметры порядка, которые использовались для количественной оценки структурного сходства (рис. 4 A и B , Middle и Bottom ). Мы также наблюдали барьеры между модельной и экспериментально определенной структурой в профилях свободной энергии для нескольких других целей ( SI Приложение , рис. S4). Такой барьер, по-видимому, замедлит попытки уточнения с использованием только прямой молекулярной динамики при постоянной температуре.Ниже мы обсудим очевидное происхождение этого барьера и несколько способов преодоления этого барьера с целью эффективного уточнения структур, близких к естественным.

Поверхности свободной энергии, построенные на основе зонтичной выборки Q _diff TR872. Поверхности показаны с двумя типами координат реакции: среднеквадратичное значение ( A ) и значения Qw ( B ). Каждая поверхность показана как функция сходства как со структурой модели, так и с исходной структурой. ( A и B , Top ) Существует очевидный барьер между бассейнами, наиболее близкими к экспериментально определенной структуре (бассейн A), и бассейнами, наиболее близкими к модельной структуре (бассейн B). ( A и B , Middle ) Среднее значение и стандартное отклонение точности боковой цепи для захороненных и открытых остатков, рассчитанные как функция этих же координат реакции. Они показаны отдельно для ароматических остатков и для неароматических остатков. ( A и B , Bottom ) Значение математического ожидания и стандартное отклонение статистического потенциала всех атомов, RWplus, рассчитанные как функция этих же координат реакции.

Точность ротамеров с боковой цепью.

Как только пептидный остов предсказанной структуры находится в пределах нескольких ангстрем от остова экспериментально определенной структуры, любые оставшиеся значительные различия между предсказанными и экспериментальными структурами, вероятно, будут вызваны различиями в ориентации боковых цепей. Правильная ориентация боковой цепи может играть роль в правильной настройке сайтов связывания для лекарств и катализа и, таким образом, является интересной мерой качества структуры.Определение ориентации боковых цепей происходит медленно, особенно внутри переполненного белка. Здесь мы вычислили долю углов ротамера боковой цепи, которые находятся в пределах 40 ^○ их соответствующих значений в кристаллических структурах (значение, обычно принимаемое для присвоения дискретных состояний ротамера). Мы отдельно отслеживаем эту фракцию на предмет скрытых остатков, переориентация которых сильно связана с белком в глобальном масштабе, и остатков на поверхности, которые относительно свободно вращаются в растворителе.Наши расчеты показывают, что захороненные ароматические остатки обычно менее правильно размещены, чем захороненные неароматические остатки, в том, что касается их угла χ1, но точность предсказанных углов χ2 выше для захороненных ароматических остатков, чем для захороненных неароматических остатков ( SI Приложение , рис. S2). Последнее наблюдение может быть объяснено более ограниченным априорным распределением углов χ2 для ароматических остатков, чем для неароматических остатков, происходящих из стереохимии (33).Для краткости мы называем точность групп захороненных остатков в конструкции «bAccuracy» и аналогичным образом называем точность групп обнаруженных на поверхности остатков «sAccuracy».

Мы подробно исследовали точность ориентации боковых цепей для ряда смоделированных структурных ансамблей TR872. Ансамбли были созданы с использованием смещенной выборки, которая была разработана для исследования ландшафта свободной энергии между двумя эталонными структурами. Одной эталонной структурой была экспериментально определенная структура.Другой эталонной структурой была структура, созданная во время уточняющего моделирования TR872 под управлением ПК, которая имела наименьшее среднеквадратичное значение экспериментальной структуры. Полученные повторно взвешенные ландшафты свободной энергии как функция сходства с эталонными структурами можно увидеть на рис. 4. При использовании либо среднеквадратичных значений, либо долей правильных попарных расстояний, Qw, до эталонных структур, два доминирующих бассейна свободной энергии могут быть замеченным на пейзаже. Мы обозначаем эти бассейны как «бассейн A» и «бассейн B.Бассейн А — это бассейн на ландшафте, ближайший к экспериментально определенной структуре. Бассейн B находится примерно на одинаковом расстоянии от экспериментально определенной структуры и уточненной структуры.

В бассейне B точность определения углов χ1 для ароматических остатков оказалась ниже, чем для неароматических остатков (рис. 4 A и B , Middle ). Среднее значение χ1 bAccuracy увеличивается в среднем по мере уменьшения среднеквадратичного значения кристаллической структуры, указывая на то, что точность основной цепи и точность боковой цепи действительно связаны в почти естественных структурных ансамблях.Дисперсия bAccuracy меньше в естественном бассейне (бассейн A), чем в бассейне B: конформации боковой цепи значительно более ограничены для конформаций скелета, близких к экспериментально определенной структуре. Точность открытых боковых цепей ниже, чем точность скрытых боковых цепей, и демонстрирует более высокую степень вариации: состояния ротамера открытых остатков на поверхности менее четко определены, чем состояния ротамера скрытых остатков. Взятые вместе, эти результаты показывают, что одним из узких мест при уточнении структур, начиная с моделей, близких к естественным, является коррекция углов χ1 ароматических остатков.Поскольку в лабораторных условиях перевороты ротамера боковой цепи могут занимать миллисекунды или даже больше (24), неспособность в достаточной мере определить углы χ1 ароматических остатков путем прямого моделирования в наносекундных временных масштабах, очевидно, является проблемой, которую необходимо преодолеть, если структура, основанная на молекулярной динамике схемы доработки должны быть полностью успешными.

Уменьшение барьера двугранных боковых цепей еще больше улучшает схему уточнения структуры с помощью ПК.

Можно представить несколько способов ускорения изомеризации боковых цепей белка.Здесь мы решили уменьшить энергетические барьеры между ротамерами с боковыми цепями, используемыми в силовом поле для всех типов остатков, уменьшив вдвое силовую константу двугранного потенциала (34). По-прежнему будет существовать барьер для переориентации из-за упругой деформации белковой среды, такой же, как при диффузии межузельных атомов в металле (35). В моделировании выборки Q _diff TR872 с уменьшенными барьерами кажущиеся барьеры свободной энергии, разделяющие модель и естественные бассейны (бассейны A и B на рис.5 A ), тем не менее, были значительно сокращены (рис. 5 B ). Это уменьшение кажущейся высоты барьера также наблюдалось, когда барьеры изомеризации боковой цепи только для ароматических остатков были уменьшены: алифатические остатки хорошо уравновешиваются в настоящих временных масштабах моделирования. Таким образом, медленная изомеризация ароматических боковых цепей, по-видимому, является основным препятствием для дальнейшей очистки. Стерическое скопление во внутренней части белка — еще один важный эффект, замедляющий вращение боковых цепей.Следовательно, вращение боковой цепи может быть дополнительно ускорено за счет уменьшения ван-дер-ваальсовых радиусов атомов в больших остатках боковой цепи. Конечно, нужно быть осторожным, чтобы любые средства, используемые для ускорения движений, не нарушали также и равновесные структуры неблагоприятным образом.

Уменьшение двугранных барьеров боковой цепи снижает кажущийся барьер свободной энергии между модельной структурой и экспериментальной структурой. ( A – C ) Свободная энергия, построенная на основе термодинамического отбора проб TR872 Q _diff с использованием ( A ) силового поля CHARMM36m, ( B ) силового поля CHARMM36m с двугранными барьерами боковой цепи ароматических остатки уменьшены вдвое, и ( C ) силовое поле CHARMM36m с двугранными барьерами боковых цепей всех остатков уменьшено вдвое.Профили кажущейся свободной энергии показаны как функция двух типов координат реакции, rmsd ( A – C , слева ) и Qw ( A – C , справа ). Снижение барьеров боковой цепи ароматических остатков снижает большую часть кажущегося барьера свободной энергии по направлению к нативному состоянию, что было замечено при моделировании полного барьера, в то время как уменьшение барьеров боковой цепи всех типов остатков по существу устраняет барьер.

Таким образом, мы затем протестировали влияние снижения барьеров изомеризации ротамера боковой цепи на производительность схемы уточнения структуры под управлением ПК для TR872, проведенной, как и раньше, но с более низкими барьерами.В течение того же времени моделирования, которое использовалось ранее (50 нс), набор имитаций с уточнением нижнего барьера сгенерировал структуры со среднеквадратичными значениями, аналогичными лучшим расчетам, полученным с использованием стандартного силового поля. Уточнения нижнего барьера также дали значительно улучшенные значения Qw ( SI Приложение , рис. S6). Мы расширили уточняющее моделирование, используя как стандартные, так и силовые поля с пониженным барьером, с 50 нс до 200 нс. Моделирование сокращенных барьеров продолжительностью более 200 нс демонстрирует явно лучшую детализацию, чем моделирование в долгосрочном масштабе с исходными барьерами.Моделирование под управлением ПК с использованием уменьшенных барьеров изомеризации боковой цепи последовательно снижает среднеквадратичное значение выбранных структур из экспериментально определенной структуры, в конечном итоге достигая среднеквадратичного значения всего 1,901 Å. Мы протестировали процедуру с использованием уменьшенного силового поля барьера на двух дополнительных мишенях, TR884 и TR948. Обе эти цели также демонстрируют улучшенное структурное совершенствование с использованием уменьшенных барьеров (рис. 2 и таблица 1).

Важно помнить, что белки не остаются замороженными в единой структуре, а образуют ансамбль на ландшафте (26).Поэтому мы исследовали, позволяет ли улучшенная выборка, возникающая в результате снижения барьеров изомеризации боковой цепи, реконструировать этот ансамбль путем неограниченной выборки, начиная с модельных структур или экспериментально определенных структур. С этой целью мы выполнили дополнительный набор из четырех 100-нс неограниченных расчетов постоянной температуры (300 K) для TR872, исходя из уточненной модельной структуры, а также из кристаллической структуры. Мы использовали как полубарьерные, так и полнобарьерные силовые поля.Тест Колмогорова – Смирнова (К.С.) позволяет количественно оценить сходство различных ансамблей (36). Поэтому тест KS, основанный на значениях взаимной Qw пар структур из смоделированных ансамблей, был использован для проверки сходства различных ансамблей. Тест KS показывает, что ансамбли, которые были созданы, исходя из модели и экспериментальных структур, более похожи друг на друга, когда используется силовое поле с уменьшенными барьерами изомеризации боковой цепи, чем когда ансамбли генерируются с использованием силового поля с барьеры полной изомеризации ( SI Приложение , рис.S5).

Обсуждение и заключение

Экспериментально определенные структуры и собственные ансамбли.

Рентгеновская дифракция широко считается золотым стандартом для определения структуры белков. Теперь, когда с помощью моделирования и других экспериментальных методов определения структуры можно получить структурные модели, близкие к экспериментальной точности дифракции рентгеновских лучей или даже в пределах нее, разумно задаться вопросом, могут ли структуры, полученные этими другими методами, в некотором смысле быть, Лучшее представление структур, отобранных молекулой в растворе, чем рентгеновские структуры.Есть по крайней мере два априорных способа, с помощью которых структурные ансамбли, полученные моделированием, могут лучше представлять молекулу, чем структуры, указанные в исследованиях дифракции рентгеновских лучей: ансамбль в растворе и ( ii ) даже средняя структура моделируемого ансамбля может быть более точной, чем рентгеновская структура, из-за посторонних влияний в кристалле, например, кристаллических контактов. Если в качестве критерия использовать консенсус между методами, влияние кристаллов на среднюю структуру кажется довольно слабым.Недавно Хео и Фейг (27) показали, что силовое поле молекулярной динамики, используемое в настоящем исследовании, создает ансамбли с минимальной свободной энергией, центрированные в пределах 0,8–2,0 Å Cα среднеквадратичного отклонения от экспериментально определенных структур для всех восьми целей уточнения, которые они проверено. Их анализ, однако, также показывает, что существует значительное структурное разнообразие в термически доступных ансамблях этих белков, возможно, большее разнообразие, чем некоторые могут себе представить. Оба этих результата согласуются с нашими настоящими выводами.За некоторыми заметными исключениями, белковые структуры на основе дифракции рентгеновских лучей почти всегда депонируются в структурные базы данных в виде уникальных наборов трехмерных координат. Однако многие эксперименты показывают, что белки в растворе образуют многочисленные конформации (26). Было показано, что даже при определении структуры белков в кристаллах рентгенограммы лучше объясняются ансамблем структур, чем отдельной структурой (37, 38).

Хотя белковые скелеты, по-видимому, в значительной степени не подвержены влиянию кристаллов, то же самое в целом неверно для ориентации боковых цепей.Когда дифракция рентгеновских лучей используется для определения структуры одного и того же белка в различных кристаллических средах, ориентации боковых цепей структур часто не совпадают (39, 40), особенно когда кристаллы имеют разные пространственные группы. Это несоответствие наиболее заметно для боковых цепей, которые находятся на поверхности белка, но также существует для боковых цепей, которые скрыты внутри белка (41). Уровень согласия между ориентациями боковых цепей в нескольких рентгеновских структурах одного и того же белка лишь немного выше, чем уровень согласия, который мы обнаружили между ориентациями боковых цепей почти нативных смоделированных ансамблей и соответствующими кристаллическими структурами. .В нашем моделировании «точность» ротамеров с открытыми на поверхности боковыми цепями оказалась в среднем всего 50–60% для структур, близких к естественным (среднеквадратичное значение 1-2 Å), что было определено путем сравнения с одним X -лучевая структура, тогда как сравнение множественных рентгеновских структур предполагает взаимное согласие в ориентации открытых боковых цепей на уровне 75%. Согласие между рентгеновскими структурами и моделируемыми ансамблями, близкими к естественным, для скрытых боковых цепей выше, около 90%, но все еще не идеально.При сравнении нескольких рентгеновских структур было обнаружено, что ориентации скрытых боковых цепей совпадают примерно в 95% случаев (41). Таким образом, дно складной воронки лучше рассматривать как кальдеру (42) с умеренной шероховатостью, а не как особую точку.

Мы также должны помнить, что подход, который мы принимаем даже в идеальных условиях, позволяет предсказать структурный ансамбль мономерного белка в растворе. Кристаллические структуры, по-видимому, в большинстве случаев лежат внутри или очень близко к этим предсказанным ансамблям растворов, но на структуры мономеров в кристаллах может влиять присутствие олигомерных партнеров.Если структура одного белка зависит от его олигомерного партнера, белковый комплекс необходимо полностью смоделировать после уточнения. Если присутствуют кофакторы, такие как лиганды, гемы и ионы, их также необходимо будет включить в структурное уточнение, основанное на чисто физических силовых полях. В нашей панели анализов белки, которые содержат явно связанные ионы или гемовые группы, такие как TR922 (два кальция связаны) и TR891 (гемовые связи), не были очищены, как и те, которые не содержат таких кофакторов. SI Приложение , таблица S1 содержит сводку результатов уточнения и примечания для каждой цели уточнения, указывающие, была ли решена цель в комплексе с другим белком или в комплексе с кофактором.

Поиск внизу воронки.

Ранние теоретические рассмотрения проблемы сворачивания белка столкнулись с идеей, что для завершения полностью неуправляемого поиска белком его нативного состояния во всем его конформационном пространстве потребуется во много раз больше возраста Вселенной.Теперь мы понимаем, что полный поиск в конформационном пространстве не нужен: предвзятый случайный поиск, который руководствуется сильными нативными взаимодействиями в направленном энергетическом ландшафте, позволяет белкам сворачиваться в биологических временных масштабах (43, 44). На первый взгляд может показаться загадочным, почему было так сложно предсказать и уточнить структуру белка с помощью молекулярного моделирования, даже когда доступны точные энергетические функции. Разрешение этого кажущегося парадокса заключается в том, что в нижней части воронки неровность ландшафта, по-видимому, достаточно велика, чтобы дать временные шкалы уравновешивания, которые бросают вызов текущим вычислительным ресурсам, даже если они недостаточно велики, чтобы создать проблему для физиологии.

Мы видели, что как только структура белка оказывается на достаточно малом среднеквадратичном расстоянии от экспериментально определенной структуры с точки зрения эффективной координаты реакции, она спонтанно переходит в состояние, очень близкое к кристаллической структуре. Наши симуляции, соединяющие модельную структуру и экспериментально определенную структуру TR872, демонстрируют эту точку зрения (рис. 4 A ). Как только структура достигает 2,5 Å (или Qw ≥ 0,8) экспериментальной структуры с точки зрения среднеквадратичного значения CA, как статистический потенциал (оценка RWplus), так и точность боковой цепи (bAccuracy) приобретают почти идеальную корреляцию со среднеквадратичным значением. , и в этом «радиусе» почти нет барьера между нативом и другими структурами.

Анализ ландшафта свободной энергии, по-видимому, предполагает наличие небольшого кинетического барьера, отделяющего бассейн около экспериментальной структуры от других близких к естественным структурам. Недостаточная выборка во время нашего моделирования Q _diff может переоценить высоту такого барьера из-за памяти структур, используемых для инициализации моделирования, в то время как использование несовершенных координат реакции смещает эту выборку, вероятно, приводит к недооценке барьера, поэтому указанную здесь высоту барьера следует считать несколько неопределенной.Однако важно отметить, что мы определили, что исправления двугранных боковых цепей — это движения, которые вносят вклад в этот барьер. Уменьшение двугранных барьеров боковой цепи улучшает отбор проб на дне воронки (рис. 5 B и C ). Действительно, повторение нескольких прогонов по уточнению структуры под руководством ПК с более низкими двугранными барьерами боковых цепей позволило достичь более нативных белковых структур, чем моделирование с полными барьерами, которые обычно используются.

Инструменты белкового кузнеца.

Есть много предпосылок для успешной доработки под управлением ПК. Во-первых, относительно точное крупнозернистое силовое поле полезно для определения соответствующих векторов ПК для значительного изменения структур. Здесь мы использовали AWSEMER-UD (11), крупнозернистое силовое поле, которое, как было продемонстрировано, само по себе является успешным инструментом для предсказания структуры белка de novo. Учитывая набор векторов ПК, соответствующие ПК могут быть идентифицированы путем проверки на взлом по координатам ПК.

Хотя это исследование демонстрирует возможности использования протокола уточнения под управлением ПК, выбирающего только один вектор ПК в качестве координаты выборки, дальнейшие уточнения могут быть достигнуты путем детализации по дополнительным векторам ПК. Чтобы продемонстрировать эту возможность, мы геометрически изменили структуру TR872, последовательно заменив значения PC исходной модели на значения исходной структуры. Результирующая кривая среднеквадратичного отклонения от количества замененных значений ПК ( SI Приложение , рис.S3) показывает, что коррекция 15 ПК с наибольшими собственными значениями без какой-либо дополнительной вероятностной выборки приводит к структуре со среднеквадратичным отклонением 1,5 Å от экспериментальной структуры. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы найти наилучший способ переупорядочения векторов PC, чтобы выборка по минимальному их количеству привела к максимальному уточнению предсказанных структур с крупнозернистой структурой.

В этой статье мы проиллюстрировали, как подход под управлением ПК может улучшить предсказанные структуры белков до их кристаллических структур.Текущий метод также может быть использован для уточнения структур среднего разрешения, полученных, например, с помощью методов крио-ЭМ, или для выборки конформаций белков, претерпевающих большие конформационные переходы. Протокол похож на то, как кузнецы выковывают мечи. Это оказывается очень эффективным в вычислительном отношении. В реальном кузнечном деле важным аспектом является многократное нагревание и охлаждение образца. Естественным продолжением текущего протокола было бы объединение механических деформаций под управлением ПК с непрерывным моделированным отпуском, который выполняет управляемое случайное блуждание в температурном пространстве (45, 46).Можно также рассмотреть возможность проведения моделирования обмена гамильтоновой репликой с репликами, которые имеют разную силу барьеров изомеризации ротамеров боковой цепи, чтобы использовать ускорение, разрешенное за счет снижения барьеров, без ущерба для структурной специфичности, достигаемой при использовании полной высоты барьера. Используя возможности этих ортогональных методов в усовершенствовании, мы можем вскоре ожидать, что более точные структуры станут повседневно доступными из расчетных прогнозов с точностью, соперничающей с определениями дифракции рентгеновских лучей.

Материалы и методы

Анализ главных компонентов моделирования AWSEMER-UD.

Анализ главных компонентов (PCA) — это процедура поиска набора взаимно ортогональных векторов для описания многомерного набора данных. Коэффициенты первого вектора определяются так, чтобы дисперсия многомерных входных данных в этом направлении была максимальной. Второй вектор ортогонален первому и указывает в направлении, которое максимизирует оставшуюся дисперсию входных данных и т. Д.В контексте динамики белка PCA использовался для описания существенной динамики белка на основе коррелированных колебаний атомистических положений (47, 48). Чтобы получить хорошо отобранный ансамбль для анализа PCA, мы использовали крупнозернистое силовое поле AWSEMER-UD (49). AWSEMER-UD первоначально был описан в исх. 11. Здесь мы приняли вариант AWSEMER-UD и инициализировали моделирование из структур, которые были предоставлены участникам конкурса по уточнению структуры CASP12 (28).Полный гамильтониан, используемый во время крупномасштабного моделирования, приведен в формуле. 1 : H = Vbackbone + Vcontact + Vburial + VFM + VHB + VUD − Bias. [1] Первые пять членов в уравнении. 1 взяты из стандартного потенциала AWSEM, описанного в ссылке. 12. VUD-Bias (уравнение 2 ) — это гармонический потенциал, основанный на парных контактах, выведенных из RaptorX, метода вывода контактов на основе глубокого обучения (4, 50, 51): VUD-Bias = 12kUD-Bias ( Q − 1.0) 2. [2] В уравнении. 2 , жесткость пружины kUD − Bias = 400.0 ккал / моль и Q дается в формуле. 3 : Q = 1 / ∑i, jwij∑i, jwij⋅exp− (r-restimate) 22σij2. [3] Сумма в уравнении. 3 пробегает все контакты, предсказанные RaptorX, которые имеют предсказанную вероятность больше 0,5. wij в формуле. 3 — это префактор, который пропорционален вероятности образования контакта, определенной RaptorX (50). restimate — это оценочное расстояние, зависящее от типа пары остатков, которое было получено путем обзора базы данных белковых структур (11). σij = | i − j | 0.15 Å — ширина скважины, зависящая от разделения последовательностей.

Всеатомные симуляции под управлением ПК.

Смоделированная траектория из AWSEMER-UD использовалась для анализа PCA положений атомов CA. Рассчитанные векторы PC упорядочены по собственным значениям. Собственное значение указывает величину флуктуации соответствующего движения ПК. Поскольку петля на терминальном конце белка может демонстрировать большие колебания, этот тип движения иногда может проявляться в ПК с наибольшими собственными значениями.Поскольку эти виды движений обычно не имеют отношения к структурному совершенствованию, мы используем «контактный фильтр», чтобы отфильтровать эти виды движений. Контактный фильтр вычисляет SD контактов для 10 ПК с наибольшими собственными значениями. Контакт определяется как образующийся, если соответствующие атомы CA находятся в пределах 9,5 Å друг от друга. Таким образом, контактный фильтр может улавливать ПК, которые изменяют структуру в наибольшей степени. Мы выбрали ПК с наибольшим стандартным отклонением числа контактов, чтобы направлять выборку для последующих полностью атомных симуляций.

Затем был проведен набор полностью атомных явных моделей уточнения растворителя под управлением ПК. Чтобы провести моделирование всех атомов по выбранному вектору ПК, мы применили потенциал зонтичной выборки вдоль выбранного вектора ПК. Всего в зонтичной выборке использовалось пять окон с контрольными точками в -2,0, -1,0, 0, 1,0 и 2,0 раза выше стандартного отклонения значений ПК из моделирования AWSEMER-UD, которое использовалось для получения ПК. Такой выбор зонтичной выборки обеспечивает широкий охват пространства ПК.Было только три случая, когда значение ПК экспериментально определенной структуры выходило за пределы диапазона этого выбора ( SI Приложение , рис. S1). Во всех трех случаях исходная структура находилась на расстоянии более 7 Å от экспериментально определенной структуры.

Полноатомное моделирование было выполнено с использованием силового поля CHARMM36m (Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics 36m) и временного шага 2,0 фс. Полный заряд системы нейтрализовали добавлением ионов Na и Cl, и конечная ионная концентрация была равна 0.15 М. Моделирование проводилось в ансамбле с постоянным числом, объемом и температурой частиц. Зонтичные потенциалы постепенно увеличивались в силе с течением времени, линейно увеличиваясь от 0,0 до большой жесткости пружины k = 200 кДж / моль в течение первых 1 нс и сохраняясь постоянным на этом большом значении в течение 2 нс. Затем прочность была линейно уменьшена во времени до k = 5,0 кДж / моль в течение 1 нс и удерживалась на этом значении до конца моделирования. Эта процедура обеспечивает быстрое структурное изменение белка в начале моделирования.Общее время моделирования составляло 50 нс. Моделирование проводилось с использованием GROMACS 5.1.4 (52) с патчем PLUMED-2.3.4 (53, 54). Профили свободной энергии были восстановлены с использованием метода анализа взвешенных гистограмм (WHAM) (55).

Улучшение отбора проб ротамеров с боковой цепью за счет снижения барьера изомеризации ротамеров с боковой цепью.

Изомеризация боковой цепи происходит медленно внутри белков (24). Явный барьер для изомеризации может быть уменьшен за счет уменьшения силовой константы двугранных потенциалов боковой цепи в молекулярном силовом поле (34).Стоит отметить, что эффективный барьер для изомеризации боковой цепи представляет собой комбинацию явного барьера в силовом поле молекулярной механики и фактора, зависящего от окружающей среды, возникающего в результате стерических столкновений во время попыток вращения (24). Здесь мы уменьшили силовую постоянную двугранных потенциалов вдвое по сравнению со стандартными значениями, используемыми в силовом поле CHARMM36m. Были протестированы два варианта такого восстановления: ( i ) восстановление только для ароматических остатков (His, Phe, Tyr и Trp) и ( ii ) восстановление для всех типов остатков.Мы обнаружили, что уменьшение барьеров ароматических остатков значительно снижает барьер между модельными и экспериментально определенными структурами и что уменьшение барьеров для всех типов остатков дополнительно снижает этот барьер (рис. 5). Мы протестировали эффект снижения барьера изомеризации боковой цепи наполовину для всех типов остатков на слепое уточнение структуры, выполнив моделирование уточнения под управлением ПК для трех целей: TR884, TR872 и TR948.

Выбор целей уточнения и исходных структур.

Все цели доработки были взяты из конкурса доработок CASP12. Первоначальные структуры были загружены с официального сайта CASP12. Уточненные структуры сравнивали либо с экспериментально определенными структурами, представленными на том же веб-сайте, либо, если структура там не была доступна, с соответствующими экспериментально определенными структурами, которые были депонированы в базе данных Protein Data Bank (PDB) (56).

Слепой отбор очищенных белковых структур с использованием схемы машинного обучения.

Чтобы выбрать структуры-кандидаты из нашей уточняющей выборки без использования информации об экспериментально определенной структуре, мы использовали алгоритм на основе машинного обучения, основанный на логистической регрессии. Подробности этого метода были приведены ранее (3). Вкратце, мы использовали три функции, фиксирующие качество структур для нашего обучения и прогнозов: энергии «RWplus» (31), общие энергии AWSEM, оцененные на основе структур скелета белков с помощью гамильтониана AWSEM (12), и VUD-Bias. член (4) (Ур. 2 ). Алгоритм логистической регрессии был обучен путем классификации 1% верхних структур (с наименьшим среднеквадратичным значением СА к экспериментально определенной структуре), которые были отобраны во время серии имитаций уточнения одного белка (здесь мы использовали TR866). Функция стоимости, которую необходимо минимизировать во время обучения, приведена в формуле. 4 : J (θ) = — 1m∑i = 1m [y (i) log (ŷ (i)) + (1 − y (i)) log (1 − ŷ (i))]. [4] В уравнении. 4 , m — количество обучающих примеров, θ — весовой вектор, = 1 / (1 + e − θT⋅x).y — обучающие данные, которые в данном случае представляют собой верхний 1% структур, отобранных во время моделирования уточнения TR866, как описано выше. Во время обучения веса этих трех характеристик были оптимизированы таким образом, чтобы функция стоимости J была минимизирована.

Выборка ландшафтов свободной энергии между модельными и экспериментальными структурами.

Чтобы охарактеризовать ландшафт свободной энергии в нижней части складывающейся воронки, мы выполнили набор имитаций зонтичной выборки на основе координаты реакции Q _diff , которая интерполируется между двумя заданными эталонными структурами (57): Qdiff = q (rij) −q (rij) 1 / q (rij) 2 − q (rij) 1.[5] q (rij) в уравнении. 5 приведено в формуле. 6 : q (rij) = 1 (N − 2) (N − 3) ∑j> i + 2 [e− (rij − rijN1) / 2σij2 − e− (rij − rijN2) / 2σij2]. [6 ] В формуле. 6 , σij = | i − j | 0,15 Å и q1 = qijN1, q2 = qijN2. Верхние индексы N 1 и N 2 указывают расстояния, измеренные в первой и второй эталонных структурах, соответственно. Мы выбрали структуру с наименьшим среднеквадратичным значением CA, которое было отобрано во время моделирования уточнения под управлением ПК (с полной высотой барьера), в качестве первой эталонной структуры и соответствующую экспериментально определенную структуру в качестве другой эталонной структуры.

Метрики оценки подобия структуры.

Мы использовали две метрики для измерения сходства уточненных структур с экспериментально определенными структурами. CA rmsd измеряет среднеквадратичное отклонение атомов CA в структуре от соответствующих положений атомов в экспериментально определенной структуре после выравнивания. Qw вычисляется, как показано в формуле. 7 : Qw = 2 / ((N − 2) (N − 3)) ∑j − i> 2e − rij − rijN2 / 2σij2. [7] В уравнении. 7 , rij и rijN — это расстояния между атомами СА двух остатков в модельной и экспериментально определенных структурах, а N — общее количество остатков в целевом белке.σij = | i − j | 0,15 Å — ширина скважины, зависящая от разделения последовательностей.

Оценка ротамеров с боковой цепью.

Чтобы оценить точность ротамеров с боковой цепью, мы вычислили точность боковой цепи для захороненных и открытых остатков на основе нашего моделирования (bAccuracy и sAccuracy) (3). Погребенные остатки определяются как те, которые имеют 20% или меньше нормализованных площадей, подверженных воздействию растворителя, в то время как открытые остатки определяются как те, которые имеют 50% или более нормализованных площадей, подверженных воздействию растворителя (58).Точность боковой цепи измеряли как долю скрытых остатков, у которых углы боковых цепей лежат в пределах 40 ° от углов соответствующих экспериментально определенных структур. В этом исследовании были проанализированы углы боковых цепей χ1 и χ2.

Тест на молекулярное замещение.

Следуя обычно используемым протоколам, чтобы максимизировать производительность молекулярного замещения, гибкие части входных моделей (исходная модель до уточнения и лучшие 5 слепо выбранных моделей) были удалены в соответствии с предсказанными вторичными структурами с использованием RaptorX Property (59) , алгоритм предсказания вторичной структуры белка, разработанный с использованием глубокого обучения.Все сегменты, которые, как предполагалось, были катушками, были удалены. Эти обрезанные модели были введены в Phaser под Phenix (60) для расчета показателя TFZ. Факторы B всех моделей были равномерно установлены на 0, а оценочное среднеквадратичное значение было установлено на 2,0 Å. Пространственные группы молекул в кристалле загружены в соответствии с данными, представленными на сайте PDB. Все остальные параметры остаются в значениях по умолчанию. Количество копий поиска основывалось на субъединичной стехиометрии кристаллических структур.Из 20 белков, используемых в схеме уточнения структуры под управлением ПК, только 7 белков были протестированы на молекулярную замену, потому что они имели данные дифракции рентгеновских лучей, депонированные в базе данных, и имеют относительно простую стехиометрию субъединиц (мономер или димер).

Благодарности

Мы благодарим Ганса Фрауэнфельдера, чьи героические исследования установили важность и сложность энергетического ландшафта свернутых белков, идеи, которые лежат в основе этой работы. Авторы благодарят Джорджа Филлипса и Митча Миллера за полезные обсуждения молекулярной замены и фазирования данных рентгеновской дифракции.Эта работа поддерживается Национальным научным фондом (NSF) — Центром теоретической биологической физики, грантами NSF PHY-1427654 и NSF CHE-1614101, а также грантом R01 GM44557 из Национального института общих медицинских наук. Дополнительную поддержку оказала кафедра Д. Р. Булларда-Уэлча в Университете Райса (грант C-0016, предоставленный P.G.W.).

Сноски

• Вклад авторов: X.L., N.P.S., J.N.O. и P.G.W. спланированное исследование; X.L., N.P.S., W.L., S.J., X.C., M.К. и П.Г.У. проведенное исследование; X.L., N.P.S., W.L., X.C., M.C. и P.G.W. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; X.L., N.P.S., W.L., S.J., M.C., J.N.O. и P.G.W. проанализированные данные; и X.L., N.P.S., J.N.O. и P.G.W. написал газету.

• Рецензенты: R.B.B., Национальные институты здравоохранения; и A.E.G., Лос-Аламосская национальная лаборатория.

• Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

• Размещение данных: код AWSEM доступен в Интернете по адресу https: // github.com / adavtyan / awsemmd. Код для выполнения смещения на базе ПК в GROMACS доступен в Интернете по адресу https://github.com/XingchengLin/PC-guided_protein_structure_refinement.git.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.18116/-/DCSupplemental.

Кузнечные инструменты и оборудование различных типов

Типы кузнечных инструментов

Использование соответствующих кузнечных инструментов и оборудования обеспечивает безупречную кузнечную работу.Эту кузницу иногда называют подом, потому что в ней используется под в качестве источника нагрева металла для легкой деформации. Современное кузнечно-прессовое оборудование отличается высокой степенью автоматизации, изготовлено на высокотехнологичном оборудовании и значительно облегчило жизнь кузнецов. Типы кузнечного инструмента включают в себя наковальню, долото, ключ, долото, молоток, пресс, матрицу, плоскость, пробойник и выколотку, обжимной блок, зажимные тиски и под.

Печь или очаг : используется кузнецами для нагрева металлических изделий. Он состоит из четырех опор, чугунного или стального корпуса, чугунного днища, дымохода и воздуходувки.

Наковальня : это разновидности кузнечного инструмента. Может служить верстаком кузнеца. Это большая металлическая плита, обычно сделанная из стали. Наковальня используется для выполнения различных операций, таких как выравнивание металлических поверхностей и получение форм с помощью молотка. Некоторые наковальни содержат прочные дыры и дырки. Отверстие для выносливости служит квадратным хвостовиком для выносливых, а отверстие для перфорации обеспечивает зазор для пробивки отверстия в металле.